Western Blot 實(shí)驗(yàn)，也叫蛋白質(zhì)免疫印跡實(shí)驗(yàn)，主要用于檢測(cè)和分析樣品中的特定蛋白質(zhì)。該技術(shù)涉及將蛋白質(zhì)樣品通過(guò)凝膠電泳分離，然后轉(zhuǎn)移到膜上，通常使用硝酸纖維素或聚偏氟乙烯膜。轉(zhuǎn)移后，膜上的蛋白質(zhì)與特異性抗體結(jié)合，這些抗體可以識(shí)別目標(biāo)蛋白。通過(guò)使用標(biāo)記的二抗，可以檢測(cè)出與目標(biāo)蛋白結(jié)合的抗體。最后，通過(guò)化學(xué)發(fā)光、熒光或放射性標(biāo)記等方法來(lái)可視化目標(biāo)蛋白。Western Blot實(shí)驗(yàn)廣泛應(yīng)用于生物學(xué)和醫(yī)學(xué)研究中，用于蛋白質(zhì)表達(dá)分析、疾病標(biāo)志物的檢測(cè)以及信號(hào)傳導(dǎo)途徑的研究。具體實(shí)驗(yàn)細(xì)節(jié)，請(qǐng)一起閱讀本篇文章，來(lái)了解一下Western Blot實(shí)驗(yàn)操作的全流程吧！

1. 蛋白提取：

①　準(zhǔn)備工作：收集細(xì)胞或研磨組織（對(duì)于細(xì)胞，可先去除培養(yǎng)液，用預(yù)冷的 PBS 清洗；對(duì)于組織，可采用液氮研磨或勻漿器處理）。

②　裂解細(xì)胞 / 組織：加入適量的裂解液（通常已添加蛋白酶抑制劑，防止蛋白降解），比如每 106 個(gè)細(xì)胞中加入 100μl 裂解液。裂解液的體積需根據(jù)組織總量來(lái)決定，要確保蛋白提取物不會(huì)過(guò)于稀釋?zhuān)詼p少蛋白質(zhì)損失。將細(xì)胞或組織與裂解液充分混合，在低溫（如 4℃）下持續(xù)振蕩 15-30 分鐘，期間為使細(xì)胞充分裂解，培養(yǎng)瓶要經(jīng)常來(lái)回?fù)u動(dòng)。

③　超聲處理或抽打：冰上超聲處理，一般使用 20-30% 功率，超聲 1-2 分鐘，目的是斷裂 DNA，使蛋白更好地釋放；也可以使用 1ml 注射器進(jìn)行抽打，達(dá)到類(lèi)似效果。

④　離心：低溫下以最高轉(zhuǎn)速離心 20 分鐘，上清液即為所需的蛋白樣本，將其收集到新的離心管中備用。

2. 蛋白定量：

①　蛋白標(biāo)準(zhǔn)品稀釋：用蛋白裂解液配制一系列濃度梯度的蛋白標(biāo)準(zhǔn)品。

②　加樣：取 20μl 不同濃度蛋白標(biāo)準(zhǔn)品和 20μl 蛋白樣品（如果樣品顯色過(guò)深，需要提前稀釋?zhuān)┘拥?96 孔板中，蛋白標(biāo)準(zhǔn)品和每個(gè)樣品最好設(shè)置三個(gè)技術(shù)重復(fù)。

③　配制 BCA 工作液并加樣：根據(jù)待測(cè)孔數(shù)量，按 A 液：B 液 = 50:1 配制適量 BCA 工作液，充分混勻后加入 96 孔板中，每孔 200μl。

④　孵育與檢測(cè)：將 96 孔板在 37℃放置 20-30 分鐘（也可以室溫放置 2 小時(shí)，或 60℃放置 30 分鐘），反應(yīng)結(jié)束后，用酶標(biāo)儀測(cè)定 96 孔板在 562nm 處的吸光值。

⑤　計(jì)算蛋白濃度：根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出樣品的蛋白濃度。蛋白濃度測(cè)好后，加入 Loading Buffer 變性蛋白，準(zhǔn)備上樣跑膠。

3. 制膠：

①　組裝制膠裝置：將玻璃板卡在制膠架上，底部與海綿膠條貼緊，注意提前檢查是否漏液。

②　配制分離膠：按照配方配制所需濃度的分離膠，注意 TEMED 要最后添加，充分混勻后，用移液槍小心地將分離膠溶液灌入組裝好的玻璃板中，槍頭要緊貼玻璃板內(nèi)壁。

③　液封分離膠：在分離膠表面輕緩地覆蓋一層 ddH2O，使分離膠表面平整，室溫靜置凝固約 30-60 分鐘（天氣冷時(shí)凝膠時(shí)間需延長(zhǎng)，建議提前配膠）。

④　處理分離膠：待分離膠充分凝固后，小心傾斜或倒置棄去分離膠上層的 ddH2O，用潔凈的濾紙伸入玻璃板吸走剩余的 ddH2O（注意濾紙不要觸碰到分離膠）。

⑤　配制濃縮膠：使用濃縮膠配方配制濃縮膠，同樣 TEMED 最后添加，充分混勻。

⑥　灌制濃縮膠：立即將濃縮膠溶液用移液槍小心地灌入分離膠上層，插入點(diǎn)樣梳，確保凝膠中或梳齒周?chē)鷽](méi)有氣泡，讓凝膠在室溫下凝固約 30-60 分鐘。

4. 電泳：

①　安裝凝膠：將準(zhǔn)備好的凝膠夾在電泳芯中，放置到電泳槽中，往槽中加入電泳液，如果同時(shí)跑兩塊膠，則液面達(dá)到下方刻度線，如果跑四塊膠，則液面需要到達(dá)上方刻度線，內(nèi)槽中電泳液需加滿至溢出（若整個(gè)電泳槽未加滿，開(kāi)跑后需注意中間是否會(huì)漏液）。

②　上樣：緩慢垂直向上拔出點(diǎn)樣梳，上樣前將上樣孔中的氣泡趕盡（若有），使用特定的凝膠上樣槍頭或 10μl 的槍頭往上樣孔中緩慢加入前期制備好的樣品。

③　設(shè)置電泳條件：蓋上電泳槽，開(kāi)啟電源進(jìn)行電泳（注意電極連接正確），濃縮膠的電壓通常為 80V，分離膠的電壓通常為 120V，電泳時(shí)間通常為 1 小時(shí)左右，但具體參數(shù)可根據(jù)目標(biāo)蛋白的分子量進(jìn)行相應(yīng)調(diào)整。

④　結(jié)束電泳：當(dāng)染料分子溴酚藍(lán)到達(dá)凝膠的底部時(shí)，關(guān)閉電源。此時(shí)蛋白會(huì)開(kāi)始緩慢彌散，因此要迅速進(jìn)行下一步操作。

5. 轉(zhuǎn)膜：

①　配置轉(zhuǎn)膜緩沖液：轉(zhuǎn)膜緩沖液最好配成母液，現(xiàn)配現(xiàn)用。

②　活化 PVDF 膜：PVDF 膜使用前需在甲醇中活化。

③　切膠與平衡：用 ddH2O 沖洗膠塊后切除濃縮膠和溴酚藍(lán)，在轉(zhuǎn)膜緩沖液中平衡 3-5 分鐘，留下含有目的蛋白的凝膠。

④　構(gòu)建 “轉(zhuǎn)膜三明治"：從負(fù)極到正極依次是海綿、濾紙、凝膠、PVDF 膜、濾紙、海綿，注意 PVDF 膜貼合凝膠時(shí)，避免產(chǎn)生氣泡。

⑤　轉(zhuǎn)膜：常見(jiàn)的轉(zhuǎn)膜條件是 100V，1-2 小時(shí)（電壓和時(shí)間可以根據(jù)蛋白分子量大小進(jìn)行調(diào)整）。轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，可以用麗春紅染色判斷膜上是否有蛋白，這種方法可逆無(wú)毒，耗時(shí)短。

6. 封閉：

①　配置封閉液：轉(zhuǎn)膜結(jié)束前 30min，以 TBST 為緩沖體系配置封閉液，并利用渦旋儀、搖床等儀器使封閉液充分溶解并混勻。

②　孵育：轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，在抗體孵育盒中加入適量封閉液，用鑷子夾住膜，將其wan全浸泡在封閉液中，置于搖床上室溫低速搖動(dòng)孵育 1-2 小時(shí)，也可以 4℃冰箱孵育過(guò)夜。

7. 一抗 / 二抗孵育：

①　一抗孵育：根據(jù)抗體說(shuō)明書(shū)稀釋一抗，封閉液可作為抗體稀釋液，也可使用 1×TBST 稀釋一抗。將膜浸泡在稀釋好的一抗中，保持適當(dāng)?shù)膿u動(dòng)使之均勻覆蓋，常見(jiàn)的一抗孵育條件為室溫 1.5-2 小時(shí)或 4℃過(guò)夜。

②　洗膜：一抗孵育結(jié)束后，用洗膜液（如 PBST 或 TBST，后者效果更好）洗去未結(jié)合的抗體，建議清洗 30 分鐘，或 10 分鐘 3 次 / 6 分鐘 5 次。

③　二抗孵育：參考一抗步驟稀釋二抗，將膜浸泡在二抗中，室溫孵育 45 分鐘 - 1 小時(shí)。

8. 免疫檢測(cè)：

①　洗膜：二抗孵育完畢后，回收二抗，用 TBST 洗膜，洗去未結(jié)合的二抗。

②　顯影：將發(fā)光液敷在膜上，通過(guò)化學(xué)發(fā)光成像儀曝光，采集圖像并使用 ImageJ 等軟件分析灰度值。